多糖的抗病毒活性与多糖的分子量大小、硫酸根含量以及空间构象有较大联系，本文对微波辐射制备不同分子量卡拉胶多糖及硫酸酯化修饰技术进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
标准多糖（Dextran Standard 270000、80000、12000、5000、1000和DextranBlue），卡拉胶，真空反应器，，凝胶色谱柱。
1.2 实验方法
1.2.1 微波辐射制备卡拉胶多糖
取一定量卡拉胶加水搅匀，80℃保温15min，使其充分溶解；然后加入一定量H2SO4，750W微波处理10～30min；料液先用碱调节至pH4.5，冷却后调至pH6.0。
1.2.2 硫酸酯化反应
（1）原料预处理。喷雾干燥上述料液，105℃干燥至含水量低于3％，备用。
（2）酯化试剂制备。向5L反应器中加入2000mL吡啶，置于冰水浴中充分冷却，沿反应器壁缓慢滴加氯磺酸，充分搅拌，使酯化剂溶解，形成透明的吡啶磺酸溶液。
（3）酯化反应及终点控制
恒温条件下，分批加入酯化试剂至卡拉胶样品，搅拌均匀。反应式：吡啶磺酸+卡拉胶多糖→卡拉胶硫酸化多糖+吡啶。
硫酸酯化产物中含大量的无机盐和少量的吡啶，采用纳滤系统（250Da）进行脱盐和浓缩；浓缩后物料进行喷雾干燥。工艺参数：热空气进口温度170～180℃，出口温度80～95℃，喷头压力2kg/cm2。
1.2.3 分子量测定
高效凝胶色谱法测定多糖分子量，色谱柱TSK－GEL G5000 PWXL（7.8mm×30cm），流动相为0.07％Na2SO4溶液、0.4mL/min，柱温50℃。将各标准多糖配成浓度为10mg/mL的标准液，各取25uL进样，以出峰时间和各标准样分子量的对数值绘制标准曲线。配制样品溶液、进样、测定出峰时间，根据标准曲线计算分子量。
2 结果与分析
2.1 微波辐射法制备特定分子量卡拉胶多糖条件的确定
利用微波制备特定分子量卡拉胶，具有速度快、操作简便、能耗低等优点。影响产物的主要因素包括：料液pH、处理时间、料液浓度、微波功率等。
2.1.1 料液浓度、体积和工作功率的确定
选择料液体积为600mL/次，料液浓度小于5％时，料液浓度对微波处理效果的影响不大，过高的浓度引起降解不均匀，产生大量沉淀物。故确定微波750W处理时的料液浓度为5％。
2.1.2 pH值和时间对处理效果的影响
设定处理时间10min、12min、23min、30min四个水平，处理pH值2.5、2.0、1.5三个水平；同时测定分子量<1000、1000～20000、>20000的产物峰面积。
以上结果表明，pH值对水解程度的影响十分明显，pH1.5条件太过剧烈，导致卡拉胶水解过度；pH2.5时水解程度很低，卡拉胶处于凝固态；pH2.0条件下进行水解，产物分布符合要求。
在pH2.0条件下，取时间10min、12min、23min、30min制备卡拉胶，产物分布情况见表3。
利用微波辐射酸解法制备特定分子量卡拉胶的条件为：料液浓度5％（w/w），料液体积60mL，pH2.0，750W微波处理10～30min。目标产物分子量为1000～3000Da时，微波处理时间为30min；5000～8000Da，处理时间20min；10000～12000Da，处理时间12min。
2.2 特定硫酸根取代度卡拉胶硫酸多糖制备
考察反应温度对取代度的影响，在酯化剂摩尔比为4∶1条件下，设置不同反应温度。
从上表可看出，要达到相同取代度，小分子量卡拉胶需要的反应温度低于大分子量卡拉胶。这可能是由于多糖的分子量越小，其立体结构中暴露在外的游离羟基(-OH)也就越多，还原性也就越强，达到一定取代度需要的温度也就越低。小分子量卡拉胶耐受的酯化反应温度较低，反应过程中采用梯度升温策略，更有利于得到均匀且充分酯化的卡拉胶。考察酯化剂比例对取代度的影响时，不同分子量卡拉胶要设立不同的反应温度，结果如表5所示。
结果表明，酯化剂比例和卡拉胶分子量对硫酸酯化效果的影响很大。取代度随酯化剂用量的增加而增加；分子量越小，暴露在外能参与酯化反应的羟基就越多，越容易被氧化，在规定时间内达到相同取代度所需酯化剂就越少。
3 结束语
本文开发了微波辐射法制备特定分子量卡拉胶多糖技术和硫酸酯化反应梯度升温控制策略，得到特定分子量及硫酸根取代度的卡拉胶多糖，为卡拉胶多糖的抗流感病毒活性研究奠定了基础。
